基因技术药物和基因治疗
作者：郝连杰(译)
单位：同济医科大学附属同济医院
关键词：
德国医学000301Gentechnologische Medikamente und Gentherapie
引 言
自从发现脱氧核糖核酸(DNA)是遗传信息、遗传密码的载体、限制性核酸内切酶以及建立DNA序列分析、聚合酶链反应、基因和细胞核转染等方法之后，现今已有可能在体外增殖DNA，并且能几乎无限制地在体外或体内表达。因此，基因技术对于我们了解病毒、细菌、真核细胞的遗传和分子生物学是一场革命。另一方面，基因技术几乎可以应用于医学所有的领域，对于明确疾病的分子致病机理以及诊断、治疗和预防的意义与日俱增。为此将基因技术的基础知识、治疗的里程碑“基因技术药物”和“基因治疗”综合报道于下。
, 百拇医药
基因技术的基础
各种有生命机体遗传物质是由DNA构成的，DNA位于细胞核内，构成染色体，总称为基因组。每个人类体细胞含有46个染色体(44个常染色体和2个性染色体，XX或XY)。在染色体上DNA排列形成结构-功能单元，称为基因，含有1特定的蛋白信息。人类基因组总共有100 000个基因。DNA的生物意义在于它的功能是遗传信息的载体。基因的表达有2个主要步骤：DNA转录成互补的mRNA-序列和mRNA-序列翻译成相应的氨基酸序列(图1)。DNA的核苷酸序列决定氨基酸序列，以及合成蛋白的结构和功能(基因-蛋白-关系)。
图1 基因表达(蛋白合成)与DNA-转录和mRNA翻译的原理。
常规克隆化技术 常规克隆化技术包括两个重要方面：DNA重组从载体和克隆的DNA片段或基因构建成重组DNA分子，以及将重组的DNA分子引入适当的细胞(例如细菌或酵母菌)增殖重组的DNA分子。
, 百拇医药
通过DNA重组在体外构建重组的DNA分子(图2)，常用质粒作为载体或介质，质粒是在细菌自然存在的环状染色体外DNA分子，常带有耐抗生素基因，而且能自动复制。构建重组DNA分子首先用限制性核酸内切酶将载体-DNA切成线形，需要克隆的DNA例如可从淋巴细胞制备(图2，步骤1和2)。载体DNA和克隆的DNA再用DNA结合酶(Ligase)共价相互连接起来(图2，步骤3)，构建成由克隆的DNA-片段和带有耐抗生素-基因的载体-DNA组成的重组DNA分子。
图2 常规克隆化技术的原理(DNA增殖)。
(1)载体线形化；(2)DNA-片段/基因的制备；
(3)载体与DNA片段结合成为重组DNA分子；
(4)将重组DNA分子引入细菌(转化)；
, 百拇医药
(5)在存在抗生素情况下选择和DNA增殖；(6)分离克隆的DNA。
增殖DNA的方法是将重组DNA分子引入细菌(图2，步骤4)自动复制。通过抗生素筛选出转化的细胞：因为载体带有氨基苄青霉素耐受基因，在存在氨基苄青霉素的条件下可以增殖，未转化的细菌则不能繁殖。这样可以将转化的细菌连同生长着的克隆一起选择出，确定为带有基因相同DNA分子细菌菌落(图2，步骤5)。在DNA增殖后将细菌溶解，制备出重组DNA分子，再将所期望的基因纯化分离出(图2，步骤6)。如此增殖/克隆出的基因是纯化的，可以无限量地用于杂交分析或作基因治疗。
聚合酶链反应 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增方法的建立是用重组DNA分子转化细菌或酵母菌作常规克隆的革命性进展。PCR扩增是在体外扩增DNA或RNA逆转录后形成的互补DNA(cDNA)。
PCR包括3个步骤(图3)：
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图3 聚合酶链反应扩增DNA 的原理。
1. 通过加热DNA变性(步骤1)；
2. 将寡核苷酸与形成的单链DNA结合(引物退火，primer annealing，步骤2)；
3. 聚合酶链反应向5'-3'方向延伸寡核苷酸(步骤3)。
这3个相互连接的步骤的结果使起始DNA扩增1倍，30～40个循环后起始DNA分子将增殖106～108倍。因此，PCR是检测DNA或RNA逆转录成cDNA的极其敏感的方法。扩增的DNA还可再连到载体上，继续通过常规克隆化增殖(见上述)，或者用于表达(见下文)。
DNA-表达 典型表达DNA合成所期望的蛋白质的方法是将重组DNA分子引入适当的细胞内(图4)，基因可以在所谓表达载体，例如细菌、酵母细胞或真核细胞内表达(图4，步骤4和5)。这样制备出的蛋白质，经过适当的制备成为纯品，几乎可以无限量地用于诊断、治疗和预防疾病(图4，步骤6)。
, 百拇医药
图4 基因技术蛋白合成的原理(DNA-表达)。(1～4)见图2，(5)在存在抗生素的情况下选择细菌和基因表达，(6)分离基因表达蛋白。
转基因和克隆动物 除了转化细菌、酵母菌或真核细胞外，基因还可以引入受精的卵细胞内，利用转基因动物或细胞核转移在克隆动物表达。
自然受精过程半倍体卵细胞与半倍体精子细胞相融合成为二倍体细胞，通过细胞分裂和分化形成新一代的机体，其中有来自父方和母方的遗传物质(图5A)。
图5 制备转基因和克隆动物的原理。(A)自然受精；(B)通过前核注射制备转基因动物；(C)通过体细胞转移制转基因动物，基因预先未作改变；(D)基因预先改变的转基因动物。
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图6 基因调整的原理，以活体外引入白介素2(IL-2)基因治疗肝细胞性肝癌为例。
转基因技术是将期望基因以DNA片段形式，在能看到的情况下注入受精卵前核中。转基因与细胞基因组相整合，成为基因组的一部分，继续遗传给其后代。在转基因动物或植物体内，转基因按其活性和细胞或与特异性相关的启动子将在所期望的组织内表达(图5B)。
一崭新的技术是体细胞核转移，这是取出二倍体体细胞的细胞核，将取出的细胞核转移到预先去除细胞核的卵细胞内(图5C)。体细胞和转移的细胞核可以取自胚胎组织，或者，如同山羊多利(Dolly)取自成年动物分化的体细胞，再转移到预先去核的卵细胞内。山羊波利(Polly)的问世是基因技术的另一突破。克隆波利用的是胚胎纤维母细胞细胞核，这种细胞预先在体外以人类Ⅳ因子转导过(图5D)，来自细胞核经过基因修饰的波利，在乳腺特异性β-乳球蛋白-启动子的调控下，乳腺可以产生大量人类Ⅳ因子。Ⅳ因子可以纯品形式从乳汁内分离出来，用作B型血友病的药物替代治疗。波利再以常规方式繁殖，可以从1头母羊得到1群可以生产Ⅳ因子的山羊群。理论上用类似的方法，可以用体细胞核转移制备出多种可用于诊断、治疗和预防疾病的重要蛋白质。例如，如果对于乳蛋白过敏也可以改变乳汁的成分，用相应的人类蛋白质用基因方法取代动物蛋白质(Nutriceuticals)。
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在医学上，基因技术进入诊断、治疗以及预防疾病领域日益增多，基因技术可用增殖/克隆基因用于诊断和鉴定，例如分子杂交分析、PCR、分支DNA技术、DNA测序、人类基因组计划、DNA芯片(chip)-技术以及基因治疗；此外还可用基因技术合成蛋白，用于诊断、治疗和预防疾病。现将基因技术药物和基因治疗的现状介绍于下。
图7 DNA疫苗接种的原理。肌肉注射带有适当启动子的表达质粒，质粒在肌肉细胞内转录成mRNA，在细胞浆内mRNA被翻译成编码蛋白，编码蛋白可通过MHCⅠ途径处理递呈给具有相应肽表位的CD8+细胞毒性T-细胞(CTL)。现今CTL可以不通过肌肉细胞，而通过来自骨髓的抗原递呈细胞(APC)递呈。游离的蛋白也可被递呈细胞摄取，通过MHCⅡ途径处理，递呈给CD4+T辅助细胞。CD4+T细胞支持诱导细胞和体液免疫应答。在此模型中肌肉细胞是长期产生蛋白的储备场所。
, http://www.100md.com 基因技术药物
基因技术的1个特殊重点是利用基因技术制备医学上至关重要的蛋白质，这些蛋白质多数用常规方法不能制备，或者不能充分纯化，或者不能获得足够的产量供应：例如激素、传染病的疫苗、血凝活性药物、细胞因子(干扰素、生长因子、白介素)、单克隆鼠源性、嵌合体或人源性抗体等。多数基因技术蛋白已经在临床考核中，进入临床应用者与日俱增(表1)。
表1 基因技术药物举例 激素
滤胞刺激素(FSH)
生长激素释放激素(GHRH)
人类甲促素(TSH)
人类胰岛素
黄体促素(LH)
, 百拇医药
生长激素(GH)
凝血活化药物Ⅶ，Ⅷ，Ⅳ因子
组织-胞浆素原激活因子
水蛭素
嵌合-人源性单克隆抗体
抗- B细胞CD20(Rituximab)
抗-血小板糖蛋白Ilb/IIIa受体(Abciximab)
抗-IL-2受体(Basiliximab，Daclizumab)
抗-乳腺癌p185-HER2(Trastuzumab)
抗-TNF-α(Infliximab)
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针对感染性疾病的疫苗
乙型肝炎病毒(HBV)
呼吸道合胞病毒(RSV)
细胞因子
IFN-α，β，γ
IL-1 ～IL-12
造血生长因子
红细胞生成素(EPO)
粒细胞-克隆刺激因子(G-CSF)
粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)
巨噬细胞
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干细胞-CSF(S-CSF)
血小板生成素
其它蛋白质
α-糖甙酶
α-L-艾都糖醛酶
DNAse
血红素
人类CD4
白细胞蛋白酶抑制因子
基因治疗
将遗传物质引入体细胞作为治疗或预防疾病，称为基因治疗。基因治疗的现代概念和一些医疗上应用的可行性如下：近年分子生物学分析已经是生物医学研究以及临床医学的中心问题，从而一些疾病的分子遗传学基础得到阐明。这些分析不仅使我们能更好地认识病理与基因之间的关系，而且开创了崭新的治疗前景。
, 百拇医药
基因疾病可以分为三大类：
1. 经典的单基因疾病：是个别基因的缺失所引起的疾病，按孟德尔定理遗传。临床曾报道4000种单基因疾病，已明确因为单基因缺失引起的疾病日益增多。人类基因组计划将为此作出重要贡献。
2. 复合基因疾病：这类疾病的产生和进展是因为多种、部分尚未明确的基因所致，属于这类的疾病有心脏-血管系统疾病、高血压病、关节炎等。
3. 获得性基因疾病：其中有各种肿瘤和感染性疾病。这些疾病通过染色体DNA突变以及通过感染所形成的新的遗传物质与病原体一起遗传给子代。
根据遗传学疾病分类基因治疗的原则包括下列几方面(表2)：
表2 基因治疗 疾病
基因治疗
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单基因疾病
基因替代
DNA-，RNA-修复
细胞-以及器官移植
复合基因疾病
基因增强
DNA疫苗
获得性基因疾病
基因阻断
DNA-疫苗
1. 典型的单基因疾病采用基因替代、基因修复以及细胞或器官移植。
2. 复合性基因疾病采取基因增强方法，即引入具有新功能的基因以及DNA-疫苗接种。
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3. 获得性基因疾病，例如感染性疾病和肿瘤，采取基因阻断以及DNA-疫苗接种。
4. DNA-疫苗接种，即注射裸克隆DNA，诱导医疗上有用的体液和/或细胞免疫应答。
基因替代 多数遗传性疾病是因为个别基因的错误或缺失所致，基因治疗的目的是有目的地替代相应的基因产物。一最早的临床例子是先天性腺苷脱氨酶缺乏症(Adenosin-Desaminase-Mangel，ADA)，伴有免疫功能低下，必须在无菌室内生存(bubble children，球形玻璃罩儿童)。通过活体外转导克隆化正常ADA基因给患者的T-淋巴细胞，体外增殖后再输入给患者，可使缺陷基因得到临床治疗。其它基因治疗策略是DNA 以及RNA-修复和细胞或器官移植，再此暂不作探讨。
基因增强 临床最常见的是多种因素所引起的复合性基因疾病，例如肿瘤、心脏-血管疾病。这些复合性疾病的现代基因治疗策略是在局部表达生理性基因产物以及直接或间接作用的细胞毒性蛋白。有目的地局部产生具有治疗作用的蛋白质，与全身用药相比，其优点是对整个机体的副作用较少。例如白介素-2(IL-2)以及肿瘤坏死因子(TNF)，在肿瘤治疗时给予这些细胞因子，可刺激机体本身产生针对肿瘤的防御能力，促使肿瘤组织的清除(图6)。通过局部表达IL-2以及TNF也降低这些细胞因子的毒性作用。其它基因治疗措施是引入肿瘤抑制基因，针对化疗的副作用可引入多种药物耐药基因(MDR)保护骨髓细胞，以及肿瘤细胞内引入可调节的自杀基因(Suizidgenen)，活化细胞自我破坏作用。
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基因阻断 这治疗措施首先应用于感染性疾病和肿瘤，例如乙型肝炎病毒(HBV)感染或人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，可以认为是获得性基因疾病。病毒与癌基因序列的清楚认识，为基因治疗病毒性疾病和肿瘤开创了崭新的前景。基因治疗的目的是阻断在细胞存在引起疾病的细胞突变基因。基本上基因信息表达的每一个步骤都可以进行治疗性干预，例如通过序列特异性转录因子与寡核苷酸结合；通过三联-螺旋-结合；通过核酶破坏DNA或RNA；通过反义DNA或RNA终止翻译，以及通过蛋白-蛋白或蛋白核酸相互作用灭活蛋白；通过表达蛋白，包括抗体干扰疾病特异性蛋白，使细胞内获得免疫等。
DNA疫苗接种 接种裸DNA也称为基因免疫，是诱导医学上有益的体液和细胞免疫应答的新策略。其依据是直接肌肉注入裸DNA形式表达质粒，可以观察到质粒在骨骼肌内持续表达编码蛋白，这样可以获得针对表达蛋白强有力的体液和细胞免疫应答。在此所产生的蛋白是机体本身细胞表达的、经过天然处理的免疫应答。因此在各种动物模型通过基因免疫可以诱导出针对病毒、细菌和寄生虫病原体等的免疫应答。图7简述DNA疫苗接种的原理。
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基因转移 基因治疗的一个重要观点是可重复地引入遗传物质至恰当的靶细胞或组织，原则上有病毒法和非病毒法，病毒转移法的原理是用经基因修饰的病毒作为遗传物质的输送病毒载体(virale Vektoren)。多种病毒可用作载体，往往在活体外进行病毒基因转移，分离出靶细胞，在体外感染重组病毒，最后再植入机体体内。这方法的优点是靶细胞可以准确的鉴定，同时基因转移本身可以得到证实。其中研究最多的病毒载体是逆转录病毒和腺病毒。非病毒法也可用于基因转移，例如DNA分子与一生理性配体结合，在体外或体内获得受体-介导细胞特异性接受DNA 或RNA(例如去唾液酸糖蛋白，转铁蛋白)。此外还有不依赖受体的方法，例如用基因阳离子脂质复合体或包裹在脂质体内的DNA直接注射给靶细胞。
总结与展望
基因技术通过常规克隆化或PCR-扩增可以在体外分离、扩增、鉴定与表达基因，人类基因计划破译人类遗传信息，将为更好地了解分子发病机理提供了可能性。另一方面在医学实践中应用基因技术与日俱增，除了用于分子诊断外，特别是还可利用基因技术制备药物作基因治疗。为临床实践提供的分子试验系统的范围日愈扩大，在诊断、治疗和预防疾病等领域中，重要的医疗抉择与分子生物学思维相结合将越来越密切。
Hubert E .Blum(Medizinische Universitätsklinik Freiburg,Abteilung Innere Medizin II,D-79106 Freiburg, Germany), http://www.100md.com
单位：同济医科大学附属同济医院
关键词：
德国医学000301Gentechnologische Medikamente und Gentherapie
引 言
自从发现脱氧核糖核酸(DNA)是遗传信息、遗传密码的载体、限制性核酸内切酶以及建立DNA序列分析、聚合酶链反应、基因和细胞核转染等方法之后，现今已有可能在体外增殖DNA，并且能几乎无限制地在体外或体内表达。因此，基因技术对于我们了解病毒、细菌、真核细胞的遗传和分子生物学是一场革命。另一方面，基因技术几乎可以应用于医学所有的领域，对于明确疾病的分子致病机理以及诊断、治疗和预防的意义与日俱增。为此将基因技术的基础知识、治疗的里程碑“基因技术药物”和“基因治疗”综合报道于下。
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基因技术的基础
各种有生命机体遗传物质是由DNA构成的，DNA位于细胞核内，构成染色体，总称为基因组。每个人类体细胞含有46个染色体(44个常染色体和2个性染色体，XX或XY)。在染色体上DNA排列形成结构-功能单元，称为基因，含有1特定的蛋白信息。人类基因组总共有100 000个基因。DNA的生物意义在于它的功能是遗传信息的载体。基因的表达有2个主要步骤：DNA转录成互补的mRNA-序列和mRNA-序列翻译成相应的氨基酸序列(图1)。DNA的核苷酸序列决定氨基酸序列，以及合成蛋白的结构和功能(基因-蛋白-关系)。
图1 基因表达(蛋白合成)与DNA-转录和mRNA翻译的原理。
常规克隆化技术 常规克隆化技术包括两个重要方面：DNA重组从载体和克隆的DNA片段或基因构建成重组DNA分子，以及将重组的DNA分子引入适当的细胞(例如细菌或酵母菌)增殖重组的DNA分子。
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通过DNA重组在体外构建重组的DNA分子(图2)，常用质粒作为载体或介质，质粒是在细菌自然存在的环状染色体外DNA分子，常带有耐抗生素基因，而且能自动复制。构建重组DNA分子首先用限制性核酸内切酶将载体-DNA切成线形，需要克隆的DNA例如可从淋巴细胞制备(图2，步骤1和2)。载体DNA和克隆的DNA再用DNA结合酶(Ligase)共价相互连接起来(图2，步骤3)，构建成由克隆的DNA-片段和带有耐抗生素-基因的载体-DNA组成的重组DNA分子。
图2 常规克隆化技术的原理(DNA增殖)。
(1)载体线形化；(2)DNA-片段/基因的制备；
(3)载体与DNA片段结合成为重组DNA分子；
(4)将重组DNA分子引入细菌(转化)；
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(5)在存在抗生素情况下选择和DNA增殖；(6)分离克隆的DNA。
增殖DNA的方法是将重组DNA分子引入细菌(图2，步骤4)自动复制。通过抗生素筛选出转化的细胞：因为载体带有氨基苄青霉素耐受基因，在存在氨基苄青霉素的条件下可以增殖，未转化的细菌则不能繁殖。这样可以将转化的细菌连同生长着的克隆一起选择出，确定为带有基因相同DNA分子细菌菌落(图2，步骤5)。在DNA增殖后将细菌溶解，制备出重组DNA分子，再将所期望的基因纯化分离出(图2，步骤6)。如此增殖/克隆出的基因是纯化的，可以无限量地用于杂交分析或作基因治疗。
聚合酶链反应 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增方法的建立是用重组DNA分子转化细菌或酵母菌作常规克隆的革命性进展。PCR扩增是在体外扩增DNA或RNA逆转录后形成的互补DNA(cDNA)。
PCR包括3个步骤(图3)：
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图3 聚合酶链反应扩增DNA 的原理。
1. 通过加热DNA变性(步骤1)；
2. 将寡核苷酸与形成的单链DNA结合(引物退火，primer annealing，步骤2)；
3. 聚合酶链反应向5'-3'方向延伸寡核苷酸(步骤3)。
这3个相互连接的步骤的结果使起始DNA扩增1倍，30～40个循环后起始DNA分子将增殖106～108倍。因此，PCR是检测DNA或RNA逆转录成cDNA的极其敏感的方法。扩增的DNA还可再连到载体上，继续通过常规克隆化增殖(见上述)，或者用于表达(见下文)。
DNA-表达 典型表达DNA合成所期望的蛋白质的方法是将重组DNA分子引入适当的细胞内(图4)，基因可以在所谓表达载体，例如细菌、酵母细胞或真核细胞内表达(图4，步骤4和5)。这样制备出的蛋白质，经过适当的制备成为纯品，几乎可以无限量地用于诊断、治疗和预防疾病(图4，步骤6)。
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图4 基因技术蛋白合成的原理(DNA-表达)。(1～4)见图2，(5)在存在抗生素的情况下选择细菌和基因表达，(6)分离基因表达蛋白。
转基因和克隆动物 除了转化细菌、酵母菌或真核细胞外，基因还可以引入受精的卵细胞内，利用转基因动物或细胞核转移在克隆动物表达。
自然受精过程半倍体卵细胞与半倍体精子细胞相融合成为二倍体细胞，通过细胞分裂和分化形成新一代的机体，其中有来自父方和母方的遗传物质(图5A)。
图5 制备转基因和克隆动物的原理。(A)自然受精；(B)通过前核注射制备转基因动物；(C)通过体细胞转移制转基因动物，基因预先未作改变；(D)基因预先改变的转基因动物。
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图6 基因调整的原理，以活体外引入白介素2(IL-2)基因治疗肝细胞性肝癌为例。
转基因技术是将期望基因以DNA片段形式，在能看到的情况下注入受精卵前核中。转基因与细胞基因组相整合，成为基因组的一部分，继续遗传给其后代。在转基因动物或植物体内，转基因按其活性和细胞或与特异性相关的启动子将在所期望的组织内表达(图5B)。
一崭新的技术是体细胞核转移，这是取出二倍体体细胞的细胞核，将取出的细胞核转移到预先去除细胞核的卵细胞内(图5C)。体细胞和转移的细胞核可以取自胚胎组织，或者，如同山羊多利(Dolly)取自成年动物分化的体细胞，再转移到预先去核的卵细胞内。山羊波利(Polly)的问世是基因技术的另一突破。克隆波利用的是胚胎纤维母细胞细胞核，这种细胞预先在体外以人类Ⅳ因子转导过(图5D)，来自细胞核经过基因修饰的波利，在乳腺特异性β-乳球蛋白-启动子的调控下，乳腺可以产生大量人类Ⅳ因子。Ⅳ因子可以纯品形式从乳汁内分离出来，用作B型血友病的药物替代治疗。波利再以常规方式繁殖，可以从1头母羊得到1群可以生产Ⅳ因子的山羊群。理论上用类似的方法，可以用体细胞核转移制备出多种可用于诊断、治疗和预防疾病的重要蛋白质。例如，如果对于乳蛋白过敏也可以改变乳汁的成分，用相应的人类蛋白质用基因方法取代动物蛋白质(Nutriceuticals)。
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在医学上，基因技术进入诊断、治疗以及预防疾病领域日益增多，基因技术可用增殖/克隆基因用于诊断和鉴定，例如分子杂交分析、PCR、分支DNA技术、DNA测序、人类基因组计划、DNA芯片(chip)-技术以及基因治疗；此外还可用基因技术合成蛋白，用于诊断、治疗和预防疾病。现将基因技术药物和基因治疗的现状介绍于下。
图7 DNA疫苗接种的原理。肌肉注射带有适当启动子的表达质粒，质粒在肌肉细胞内转录成mRNA，在细胞浆内mRNA被翻译成编码蛋白，编码蛋白可通过MHCⅠ途径处理递呈给具有相应肽表位的CD8+细胞毒性T-细胞(CTL)。现今CTL可以不通过肌肉细胞，而通过来自骨髓的抗原递呈细胞(APC)递呈。游离的蛋白也可被递呈细胞摄取，通过MHCⅡ途径处理，递呈给CD4+T辅助细胞。CD4+T细胞支持诱导细胞和体液免疫应答。在此模型中肌肉细胞是长期产生蛋白的储备场所。
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基因技术的1个特殊重点是利用基因技术制备医学上至关重要的蛋白质，这些蛋白质多数用常规方法不能制备，或者不能充分纯化，或者不能获得足够的产量供应：例如激素、传染病的疫苗、血凝活性药物、细胞因子(干扰素、生长因子、白介素)、单克隆鼠源性、嵌合体或人源性抗体等。多数基因技术蛋白已经在临床考核中，进入临床应用者与日俱增(表1)。
表1 基因技术药物举例 激素
滤胞刺激素(FSH)
生长激素释放激素(GHRH)
人类甲促素(TSH)
人类胰岛素
黄体促素(LH)
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生长激素(GH)
凝血活化药物Ⅶ，Ⅷ，Ⅳ因子
组织-胞浆素原激活因子
水蛭素
嵌合-人源性单克隆抗体
抗- B细胞CD20(Rituximab)
抗-血小板糖蛋白Ilb/IIIa受体(Abciximab)
抗-IL-2受体(Basiliximab，Daclizumab)
抗-乳腺癌p185-HER2(Trastuzumab)
抗-TNF-α(Infliximab)
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针对感染性疾病的疫苗
乙型肝炎病毒(HBV)
呼吸道合胞病毒(RSV)
细胞因子
IFN-α，β，γ
IL-1 ～IL-12
造血生长因子
红细胞生成素(EPO)
粒细胞-克隆刺激因子(G-CSF)
粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)
巨噬细胞
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干细胞-CSF(S-CSF)
血小板生成素
其它蛋白质
α-糖甙酶
α-L-艾都糖醛酶
DNAse
血红素
人类CD4
白细胞蛋白酶抑制因子
基因治疗
将遗传物质引入体细胞作为治疗或预防疾病，称为基因治疗。基因治疗的现代概念和一些医疗上应用的可行性如下：近年分子生物学分析已经是生物医学研究以及临床医学的中心问题，从而一些疾病的分子遗传学基础得到阐明。这些分析不仅使我们能更好地认识病理与基因之间的关系，而且开创了崭新的治疗前景。
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基因疾病可以分为三大类：
1. 经典的单基因疾病：是个别基因的缺失所引起的疾病，按孟德尔定理遗传。临床曾报道4000种单基因疾病，已明确因为单基因缺失引起的疾病日益增多。人类基因组计划将为此作出重要贡献。
2. 复合基因疾病：这类疾病的产生和进展是因为多种、部分尚未明确的基因所致，属于这类的疾病有心脏-血管系统疾病、高血压病、关节炎等。
3. 获得性基因疾病：其中有各种肿瘤和感染性疾病。这些疾病通过染色体DNA突变以及通过感染所形成的新的遗传物质与病原体一起遗传给子代。
根据遗传学疾病分类基因治疗的原则包括下列几方面(表2)：
表2 基因治疗 疾病
基因治疗
, 百拇医药
单基因疾病
基因替代
DNA-，RNA-修复
细胞-以及器官移植
复合基因疾病
基因增强
DNA疫苗
获得性基因疾病
基因阻断
DNA-疫苗
1. 典型的单基因疾病采用基因替代、基因修复以及细胞或器官移植。
2. 复合性基因疾病采取基因增强方法，即引入具有新功能的基因以及DNA-疫苗接种。
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3. 获得性基因疾病，例如感染性疾病和肿瘤，采取基因阻断以及DNA-疫苗接种。
4. DNA-疫苗接种，即注射裸克隆DNA，诱导医疗上有用的体液和/或细胞免疫应答。
基因替代 多数遗传性疾病是因为个别基因的错误或缺失所致，基因治疗的目的是有目的地替代相应的基因产物。一最早的临床例子是先天性腺苷脱氨酶缺乏症(Adenosin-Desaminase-Mangel，ADA)，伴有免疫功能低下，必须在无菌室内生存(bubble children，球形玻璃罩儿童)。通过活体外转导克隆化正常ADA基因给患者的T-淋巴细胞，体外增殖后再输入给患者，可使缺陷基因得到临床治疗。其它基因治疗策略是DNA 以及RNA-修复和细胞或器官移植，再此暂不作探讨。
基因增强 临床最常见的是多种因素所引起的复合性基因疾病，例如肿瘤、心脏-血管疾病。这些复合性疾病的现代基因治疗策略是在局部表达生理性基因产物以及直接或间接作用的细胞毒性蛋白。有目的地局部产生具有治疗作用的蛋白质，与全身用药相比，其优点是对整个机体的副作用较少。例如白介素-2(IL-2)以及肿瘤坏死因子(TNF)，在肿瘤治疗时给予这些细胞因子，可刺激机体本身产生针对肿瘤的防御能力，促使肿瘤组织的清除(图6)。通过局部表达IL-2以及TNF也降低这些细胞因子的毒性作用。其它基因治疗措施是引入肿瘤抑制基因，针对化疗的副作用可引入多种药物耐药基因(MDR)保护骨髓细胞，以及肿瘤细胞内引入可调节的自杀基因(Suizidgenen)，活化细胞自我破坏作用。
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基因阻断 这治疗措施首先应用于感染性疾病和肿瘤，例如乙型肝炎病毒(HBV)感染或人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，可以认为是获得性基因疾病。病毒与癌基因序列的清楚认识，为基因治疗病毒性疾病和肿瘤开创了崭新的前景。基因治疗的目的是阻断在细胞存在引起疾病的细胞突变基因。基本上基因信息表达的每一个步骤都可以进行治疗性干预，例如通过序列特异性转录因子与寡核苷酸结合；通过三联-螺旋-结合；通过核酶破坏DNA或RNA；通过反义DNA或RNA终止翻译，以及通过蛋白-蛋白或蛋白核酸相互作用灭活蛋白；通过表达蛋白，包括抗体干扰疾病特异性蛋白，使细胞内获得免疫等。
DNA疫苗接种 接种裸DNA也称为基因免疫，是诱导医学上有益的体液和细胞免疫应答的新策略。其依据是直接肌肉注入裸DNA形式表达质粒，可以观察到质粒在骨骼肌内持续表达编码蛋白，这样可以获得针对表达蛋白强有力的体液和细胞免疫应答。在此所产生的蛋白是机体本身细胞表达的、经过天然处理的免疫应答。因此在各种动物模型通过基因免疫可以诱导出针对病毒、细菌和寄生虫病原体等的免疫应答。图7简述DNA疫苗接种的原理。
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基因转移 基因治疗的一个重要观点是可重复地引入遗传物质至恰当的靶细胞或组织，原则上有病毒法和非病毒法，病毒转移法的原理是用经基因修饰的病毒作为遗传物质的输送病毒载体(virale Vektoren)。多种病毒可用作载体，往往在活体外进行病毒基因转移，分离出靶细胞，在体外感染重组病毒，最后再植入机体体内。这方法的优点是靶细胞可以准确的鉴定，同时基因转移本身可以得到证实。其中研究最多的病毒载体是逆转录病毒和腺病毒。非病毒法也可用于基因转移，例如DNA分子与一生理性配体结合，在体外或体内获得受体-介导细胞特异性接受DNA 或RNA(例如去唾液酸糖蛋白，转铁蛋白)。此外还有不依赖受体的方法，例如用基因阳离子脂质复合体或包裹在脂质体内的DNA直接注射给靶细胞。
总结与展望
基因技术通过常规克隆化或PCR-扩增可以在体外分离、扩增、鉴定与表达基因，人类基因计划破译人类遗传信息，将为更好地了解分子发病机理提供了可能性。另一方面在医学实践中应用基因技术与日俱增，除了用于分子诊断外，特别是还可利用基因技术制备药物作基因治疗。为临床实践提供的分子试验系统的范围日愈扩大，在诊断、治疗和预防疾病等领域中，重要的医疗抉择与分子生物学思维相结合将越来越密切。
Hubert E .Blum(Medizinische Universitätsklinik Freiburg,Abteilung Innere Medizin II,D-79106 Freiburg, Germany), http://www.100md.com